Nacional ha participado, hasta el momento, en siete ediciones de la CONMEBOL Libertadores femenina, teniendo su mejor participación en 2021.
El Bolso jugó por primera vez este certamen en la temporada 2011 y quedó último en el grupo B con un punto. Empató 1 a 1 con Gerimex Santa Cruz el 14 de noviembre con gol de Loayza, y luego cayó ante Caracas y Santos (0-5 y 0-7, respectivamente).
En 2012, las Tricolores terminaron últimas y sin unidades en el Grupo B, al caer 8 a 0 con São José, 4 a 2 con Boca (Florencia Garrido y Juliana Castro convirtieron para Nacional), y 2 a 0 con Caracas.
En la Libertadores 2013, Nacional pudo conseguir la primera victoria en el certamen, al derrotar en la última fecha del Grupo A por 3 a 2 a JC Sport Girls de Perú con goles de Federica Silvera, Mariana Buidid y Carolina Birizamberri. Antes, había perdido 5-1 con Colo Colo (el gol tricolor lo hizo Florencia Garrido) y 3-1 con Mundo Futuro de Bolivia (Lucía Cappelletti anotó para las bolsilludas).
En 2016, Nacional tampoco logró superar la fase de grupos, al caer 1-3 con Foz Cataratas (gol de Federica Silvera), 0-7 con Generaciones Palmiranas de Colombia, y 1-3 con San Martín de Porres (gol de Keisy Silvera).
El Bolso avanzó por primera vez a la segunda fase en 2021, cuando terminó en la segunda posición del Grupo D, por detrás de Corinthians y por delante de San Lorenzo y Deportivo Capiatá. En el debut, fue triunfo por 3 a 0 sobre Capiatá con dos goles de Esperanza Pizarro y uno de Antonella Ferradans; luego, perdió 5 a 1 con Corinthians (la brasileña Poliana, en contra, convirtió el gol del equipo uruguayo), y cerró la fase con victoria por 2 a 0 sobre San Lorenzo con tantos de Yamila Badell y Esperanza Pizarro.
En cuartos de final, venció 2 a 1 a Deportivo Cali (otra vez convirtieron Badell y Pizarro); y en semifinales cayó 8 a 0 con Corinthians. En el partido por el tercer puesto, Nacional perdió por penales ante Ferroviária por 3 a 1 tras haber empatado 1 a 1 en los noventa minutos (gol de Badell para Nacional).
En 2023, Nacional terminó último en el Grupo D, al perder 0-3 con Internacional, 1-5 con Boca (gol de Oriana Fontán), y 0-4 con América de Cali. Y en 2024, las Tricolores iban a tener su séptima participación en la Copa siendo Uruguay 2, dado que la Libertadores se iba a disputar en territorio uruguayo, pero la CONMEBOL anunció el 29 de agosto de 2024 que, la Copa que comenzó el 3 de octubre, finalmente se iba a disputar en Paraguay.
En 2025, las Tricolores integraron el grupo D junto a Deportivo Cali, Libertad de Paraguay y Universidad de Chile, y quedaron eliminadas al terminar en la terera posición con dos puntos (empate con U de Chile y Libertad, y derrota ante Deportivo Cali).
Esperanza Pizarro es la jugadora que más goles convirtió para Nacional en este certamen, y también es la futbolistas que más tantos ha marcado para el Bolso en una misma edición de la Copa (cuatro en 2021).